• NSYN UniGe Genova © 2016 IIT 4881
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Gli oggetti delle principali linee di ricerca sono i) le basi molecolari della funzione sinaptica e della plasticità omeostatica; ii) la patogenesi di malattie del  sistema nervoso con particolare riferimento a geni sinaptici le cui disfunzioni inducono patologie come epilessia, autismo o ritardo mentale; iii) ingegnerizzazione e sperimentazione di nuove sonde optogenetiche in grado di modulare la trascrizione e la traduzione genica; iv) sistemi ibridi chip-neurone che permettono l’implementazione di nuovi biosensori a base neuronale e di interfacce neuroprostetiche come la retina artificiale; (v) biocompatibilità e studi neurofisiologici delle interfacce di neuroni e cellule gliali con superfici bidimensionali di grafene al fine di mettere a punto terapie rigenerative; (vi) studio del braccio dell'Octopus come modello di meccanica muscolare e dell'integrazione sensori-motoria per applicazioni biorobotiche. Il gruppo di ricerca NSYN ha un’esperienza ben consolidata nei campi della neurofisiologia, neurobiologia cellulare e molecolare, optogenetica e bioingegneria.

Laboratori

Il centro NSYN occupa circa700 m2 all’interno dell’IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino. Lo spazio include uffici e laboratori per l’elettrofisiologia, la neurobiologia molecolare e le neurotecnologie.

Elettrofisiologia

Dodici setup di patch-clamp per neuroni primari e fettine cerebrali, cinque set up MEA e tre impianti di neurofisiologia in-vivo.

Colture cellulari

Un'ampia facility di colture cellulari per linee cellulari, neuroni primari, colture organotipiche e produzione di vettori virali.

Neuroimaging

Attrezzature complete per istochimica e immunocitochimica; sistemi per microscopia confocale (Leica SP8) e TIRF e per live imaging; un microscopio confocale; microscopi a epi-fluorescenza e chemiluminescenza e sistema Neurolucida.

Neurobiologia molecolare e cellulare

Macchine di PCR e PCR in tempo reale, phosphoimagers, Biacore SPR, spettrofotometri.

Computazione

Modellistica e simulazioni di Dinamica Molecolare delle proteine neuronali. 

Strutture per la sperimentazione animale

300 m2 di area di laboratorio per servizi generali e sperimentazione in-vivo (neurochirurgia, chirurgia oftalmica, elettrofisiologia, comportamento, EEG).

Divisioni

1. Reti e Interfacce Neuronali

Sensori fluorescenti per il pH extracellulare. Abbiamo generato un sensore di pH extracellulare per monitorare la concentrazione di ioni H+ durante l’attività neuronale e i parossismi epilettici, usando una variante ingegnerizzata di GFP (E2GFP) la cui emissione in fluorescenza aumenta al diminuire del pH. E' stata ingegnerizzata una sonda chimerica in cui la regione transmembrana del recettore per PDGF espone il sensore nello spazio extracellulare; La validazione funzionale di questo sensore codificato geneticamente è stata condotta attraverso l’espressione del sensore stesso in neuroni. Utilizzando un modello in vitro di epilessia, abbiamo recentemente dimostrato per la prima volta la dimensione e le dinamiche degli shift acidici di pH extracellulare in colture neurali in condizioni simil-epilettiche. In questo contesto, è stato interessante osservare che tali shift non sono diffusi in modo uniforme, ma piuttosto localizzati in punti discreti che corrispondono a sinapsi attive. Ci proponiamo di investigare le dinamiche di variazione del pH durante l’attività fisiologica di culture neuronali in vitro, utilizzando stimolazione elettrica e/o optogenetica, e in modelli sperimentali di patologie cerebrali, allo scopo di elucidare le vie intracellulari che portano all’estrusione di H+ in neuroni iperattivi e in condizioni di acidosi.

B. Sensori fluorescenti per Ca2+/esocitosi a livello sinaptico. Lo scopo di questo progetto è di ‘vedere’ le variazioni di calcio che promuovono la trasmissione sinaptica. Questo ha a lungo rappresentato il sogno dei molti neuroscienziati interessati a combinare tecnologie ottiche e molecolari per investigare il funzionamento del cervello. Recentemente, siamo riusciti a visualizzare i segnali del calcio e il rilascio di vescicole nella stessa sinapsi, a livello del singolo potenziale d’azione. A questo scopo, abbiamo localizzato indicatori geneticamente codificati a fluorescenza verde di ultima generazione (GCaMP6) e sonde sensibili al pH a fluorescenza spostata verso il rosso (mOrange2) nelle vescicole sinaptiche, e in questo modo siamo riusciti a correlare strettamente la causa (Ca2+) e l’effetto (rilascio di vescicole) del macchinario presinaptico. Al momento, la risoluzione spaziale dei segnali calcio nei nostri esperimenti è focalizzata a livello della singola sinapsi (~1µm). Ci proponiamo di ingegnerizzare ulteriormente le sonde GCaMP6, allo scopo di migliorare la risoluzione spaziale fino a raggiungere la singola zona attiva (~200nm), per riuscire a visualizzare in modo selettivo il calcio responsabile del rilascio delle vescicole.

Attraverso il rilascio di GABA, i neuroni GABAergici producono un tono inibitorio sistematico nella corteccia cerebrale che regola la sua attività generale. Disfunzioni di tali neuroni sono causa di gravi forme di epilessia, autismo e malattie neuropsichiatriche. Recentemente è stato dimostrato che i neuroni impiantati possiedono un'imprevista capacità di migrazione nel tessuto cerebrale adulto, e quindi in grado di alleviare l'epilessia refrattaria. In una recente collaborazione con il laboratorio di V. Broccoli presso l'Ospedale S. Raffaele, fibroblasti animali e umani sono stati riprogrammati in neuroni dopaminergici TH-positivi, interneuroni parvalbuminergici e astrociti GFAP-positivi. Analisi elettrofisiologiche in vitro, ex-vivo e in-vivo hanno dimostrato che i neuroni acquisiscono le proprietà tipiche dei neuroni maturi in termini di eccitabilità, frequenza di potenziale d'azione e trasmissione sinaptica, e che si integrano nella rete cerebrale in seguito a iniezione stereotassica, rilasciando neurotrasmettitori alle nuove connessioni sinaptiche, formando contatti eccitatori e inibitori. Essendo ottenute direttamente dai pazienti attraverso la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei, le cellule neuronali GABA-indotte rappresentano una fonte ideale per trapianti cellulari nei trattamenti di epilessia refrattaria o disfunzioni cognitive. Per questi motivi, prevediamo di trapiantare tali cellule in topi con epilessia indotta da pilocarpina o modelli genetici, allo scopo di valutare la remissione da attacchi spontanei o evocati da stimoli sensoriali.

Lo scopo del progetto, svolto in collaborazione con il CNST di IIT a Milano, è l'utilizzo di polimeri organici semiconduttori come interfaccia per stimolare i neuroni e creare protesi organiche (retina artificiale), sia per il trattamento delle malattie degenerative della retina. Abbiamo dimostrato che  neuroni primari posso essere cresciuti sul polimero fotovoltaico e stimolati elettricamente dalla luce; e inoltre che retine degenerate, e quindi insensibili alla luce, messe in contatto con il polimero riacquistano una sensibilità alla luce del tutto simile alle retine normali. Recentemente abbiamo migliorato l'efficienza dell'interfaccia organica nello stimolare i neuroni, studiando vari tipi di polimeri, spessori dell'interfaccia e pattern di deposizione e sviluppato un substrato biocompatibile, flessibile e poroso. Attualmente stiamo impiantando, in posizione subretinica, una protesi con substrato di fibroina della seta nell'occhio di ratti "Royal College of Surgeons", che rappresentano un modello sperimentale della Retinite pigmentosa umana, per valutare l'efficacia dell'impianto nel recupero della sensibilità alla luce in-vivo. Risultati preliminari rivelano un miglioramento del riflesso pupillare alla luce, il recupero dei potenziali evocati visivi e un comportamento nel test luce/buio confrontabile con i parametri riscontrati negli animali vedenti. Intendiamo ottimizzare l'interfaccia per occhi di maggiori dimensioni al fine di impiantare la retina artificiale in maiali portatori di una degenerazione dei fotorecettori indotta chimicamente, ed analizzare quindi la tecnica operatoria, la tollerabilità a lungo termine e le prestazioni fisiologiche come passo finale prima di intraprendere la sperimentazione nell'uomo. Ci attendiamo di: (i) migliorare il dispositivo adattandolo alla procedura chirurgica umana; (ii) collaudare la sua struttura, efficienza e procedura di impianto; e (iii) verificare il recupero della sensibilità alla luce e dell'acuità visiva nel maiale con degenerazione retinica in stadio finale preclinico. Stiamo anche mettendo a punto nuove interfacce polimeriche basate su nuovi materiali e nuove geometrie di deposizione per sviluppare protesi retiniche più avanzate.

A. Biocompatibilità ed efficienza di interfacce grafene-neuroni. Grazie alle sue eccezionali proprietà, che comprendono stabilità, conducibilità e flessibilità, il grafene è il materiale ottimale per costruire dispositivi biocompatibili, in particolare neuroprostesi e neurointerfacce. Ci proponiamo di valutare la biocompatibilità di questo materiale con la sopravvivenza e la crescita di neuroni primari e astrociti in-vitro. Vitalità cellulare, crescita e proliferazione saranno testate su substrati di grafene, paragonandoli a condizioni standard di coltura. Gli studi sulla biocompatibilità saranno successivamente estesi ad esperimenti in-vivo su roditori a cui saranno impiantati interfacce basate sul grafene. Dopo l’iniziale caratterizzazione della biocompatibilità, procederemo alla caratterizzazione funzionale di interfacce ibride grafene-neuroni da utilizzare in applicazioni biologiche.

B. Interfacce innovative per crescita e rigenerazione neuronale. Interfacce di diversi materiali sono state costruite per la riparazione di vari tessuti. Nonostante ciò, tentativi di costruire interfacce per la riparazione del sistema nervoso centrale hanno avuto un successo limitato per il recupero funzionale del tessuto nervoso danneggiato, a causa della scarsa capacità intrinseca di rigenerazione di questo tessuto. Allo scopo di ottenere la riparazione di danni al tessuto nervoso è necessario verificare la crescita e la connettività funzionale di reti neuronali tridimensionali. Interfacce tridimensionali per reti neurali devono avere un livello gerarchico di complessità, in cui la struttura macroscopica è determinata dalla visualizzazione ad una risoluzione millimetrica e micrometrica, mentre il substrato all’interfaccia è patternato e decorato con molecole guida ad una risoluzione nanometrica. A questo scopo, ci proponiamo di utilizzare condutture multicanale per promuovere la rigenerazione del sistema nervoso periferico, e interfacce superidrofobiche (SH) per creare un supporto tridimensionale adatto allo sviluppo e la ricrescita dei neuroni. Neuroni cresciuti in tali condizioni tridimensionali mostrano una mortalità più bassa, e di conseguenza questo sistema di coltura 3D rappresenta un valido strumento per sostenere la crescita a lungo termine e il mantenimento di cellule neuronali. Ci proponiamo di sviluppare queste interfacce utilizzando materiali flessibili, biocompatibili e riassorbibili, come il policaprolattone (PCL). Data la loro naturale tendenza a degradarsi all’interno dei tessuti, i polimeri biodegradabili sono nuovi materiali estremamente promettenti per la realizzazione di microdispositivi biomedici impiantabili. Utilizzeremo una serie di test biologici per valutare le proprietà funzionali dei neuroni coltivati su questi dispositivi, comprendenti tecniche di elettrofisiologia e di microscopia. Studieremo inoltre l’espressione di marker fisiologici di maturazione neuronale e di una serie di proteine neuronali necessarie per determinare un corretto livello di eccitabilità neuronale e trasmissione sinaptica. Infine, sfrutteremo la capacità di questi dispositivi di assorbire e rilasciare lentamente sostanze che stimolano la crescita e la sopravvivenza neuronale per migliorare le capacità rigenerative del tessuto nervoso.

Questo progetto si pone come obiettivo quello di studiare le caratteristiche biofisiche e morfologiche di due strutture biologiche quali il braccio del polpo (Octopus vulgaris) e le sue ventose che, sotto diversi aspetti, suscitano un elevato interesse per la bio-robotica. In questo progetto si utilizzano tecniche di biofisica, elettrofisiologia e morfologia ad alta risoluzione. In particolare il nostro interesse è di: (i) estrarre i principi sensori-motori di controllo del sistema muscolare delle braccia; (ii) determinare le proprietà di contrazione/rilassamento e ‘stiffening’ delle varie fibre muscolari e definire quindi il loro ruolo nello svolgimento di azioni motorie; (iii) determinare i principi sensori-motori alla base dei meccanismi di adesione e distacco delle ventose da superfici di diverso tipo (iv) identificare la struttura morfologica della ventosa e le sue caratteristiche recettoriali; (v) identificare i principi di attrazione/avversione della ventosa ad agenti chimici di diversa natura. La traduzione di questi studi in ambito bio-robotico permetterà di sviluppare nuovi sistemi di muscolo-attuatore artificiale applicabili in diversi campi tecnologici (dal campo micro-chirurgico a quello industriale) e in sistemi di adesione sensorizzati attivabili. Quest’ultima linea di ricerca è svolta in collaborazione con la Dr. B. Mazzolai del CMBR@IIT di IIT a Pontedera (Pisa).

2. Networks molecolari, funzioni cerebrali e malattie del sistema nervoso

La nostra ricerca si è focalizzata sul ruolo delle proteine presinaptiche nel determinare le proprietà funzionali delle sinapsi del sistema nervoso centrale e la loro plasticità in risposta a stimoli ambientali. Diverse mutazioni in proteine presinaptiche sono state associate all’epilessia e ai disturbi dello spettro autistico (DSA). Per chiarire come questi geni inducano fenotipi patogeni, studieremo gli effetti della loro ablazione e/o sovra-espressione, sia in-vitro sia in-vivo, così da individuare il loro ruolo nella trasmissione sinaptica, nel determinare l'equilibrio tra eccitazione e inibizione, e le proprietà delle reti neurali.

In questa ottica studieremo i meccanismi molecolari della plasticità omeostatica e come è coinvolta nella patogenesi delle disfunzioni dei circuiti corticali. La nostra ipotesi di lavoro è che epilessia, autismo e ritardo mentale scaturiscano in ultima istanza da difetti nei meccanismi di plasticità omeostatica dei circuiti corticali. In primo luogo, per svelare i meccanismi fondamentali che regolano i livelli di eccitabilità neuronale, a seguito di cambiamenti dell’attività di tutta la rete neurale, studieremo come fattori di trascrizione, e in particolare il repressore trascrizionale REST, possano scalare l’eccitabilità sinaptica in risposta a cambiamenti cronici dell’attività neurale. In secondo luogo, per comprendere quale ruolo la plasticità omeostatica sinaptica abbia nei disturbi del sistema nervoso centrale, studieremo come le proteine che mediano il riconoscimento e l'interazione tra cellule, ad esempio le integrine, possano adattare in maniera omeostatica forza e specificità delle connessioni sinaptiche in risposta a deafferentazione e deprivazione sensoriale.

Un notevole sforzo è stato dedicato alla progettazione e caratterizzazione di nuove sonde e sensori optogenetici. La recente sigificativa introduzione dell’optogenetica ha reso possibile il controllo della biologia molecolare con una precisione spazio-temporale senza precedenti. Di conseguenza, ci si aspetta che lo sviluppo di nuove sonde sensibili alla luce fornisca nuovi strumenti per controllare l’attività delle proteine, e per ottenere una migliore comprensione della fisiologia cellulare in condizioni sane e patologiche. La perturbazione dell’attività trascrizionale o delle modificazioni epigenetiche può influenzare in modo notevole il fenotipo neuronale. In tal senso ci proponiamo di ingegnerizzare sonde sensibili alla luce per modulare la trascrizione genica con un’elevata precisione spazio-temporale. Attraverso l’utilizzo del dominio LOV2 sensibile alla luce, ricavato dalla pianta Avena sativa, abbiamo recentemente creato proteine ricombinanti in grado di modulare l’attività del fattore di trascrizione silenziante RE1 (RE1-silencing transcription factor, REST), un modulatore fondamentale dello sviluppo del sistema nervoso e del differenziamento verso specifici lineage neuronali. E’ stato simulato un modello della chimera costituita dal dominio LOV2 e dal dominio interagente con REST del co-repressore mSin3A, allo scopo di guidare strategie di clonaggio e ottimizzazione della regione linker. La sensibilità alla luce di queste sonde è stata caratterizzata, e i nostri risultati mostrano che tali sonde sono efficaci nel modulare contemporaneamente un gran numero di geni neuronali. Questi inibitori chimerici di REST, basati sul dominio LOV2, hanno dimostrato la loro efficacia nel regolare l’espressione di geni neurali in linee cellulari di neuroblastoma. Ci proponiamo di valutare l’efficacia delle sonde esprimendole attraverso infezione virale in neuroni primari, in condizioni fisiologiche o simil-epilettiche, allo scopo di ottenere più informazioni sul ruolo di REST nelle proprietà fisiologiche di base dei neuroni. Successivamente, sonde precedentemente selezionate saranno applicate in-vivo in modelli murini che presentano patologie neuronali associate alla sovraespressione/iperattività di REST, come i modelli murini del morbo di Huntington, epilessia o ischemia cerebrale. Inoltre, sfrutteremo le sonde trascrizionali, basate sui LOV, in diversi tipi di cellule caratterizzate da elevati livelli di espressione REST, come gli astrociti, linee derivate da tumori neuronali o astrocitari come il neuroblastoma, medulloblastoma o glioblastoma. Inoltre, nuove sonde basate sui LOV saranno ingegnerizzate e realizzate allo scopo di aumentare l’attività di REST o di regolare l’attività del fattore associato MeCP2, che è coinvolto nella patogenesi della sindrome di Rett.

Le neurotrofine rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici volti alla cura di diverse patologie del sistema nervoso centrale e periferico, come il morbo di Alzheimer e il dolore neuropatico. Questo progetto punta ad ottenere nuove conoscenze sui meccanismi dipendenti dalle neurotrofine che modulano la fisiologia dei circuiti neuronali nel cervello adulto, studiandone le proprietà di eccitabilità e plasticità. A questo scopo, utilizzeremo una serie di topi transgenici, in modo da guidare l'ablazione delle proteine di interesse specificatamente nel sistema nervoso. Ci concentreremo sulle proteine di membrana e adattatori molecolari che sono bersaglio di stimoli trofici, e partecipano alla modulazione delle vie di segnalazione intracellulare avviate da tali stimoli. Inoltre, valuteremo i meccanismi attraverso i quali le neurotrofine influiscono sull'eccitabilità neurale, attraverso la modulazione della funzionalità e la localizzazione di diverse isoforme dei canali del sodio voltaggio-dipendenti.